2.1  实验动物数量分析  模型组小鼠第7天、第14天共死亡4只，治疗组小鼠第14周死亡2只。因此，模型组于第7，14天各取6只小鼠外周血、股骨，治疗组于第14天取6只小鼠外周血、股骨，其余时间点各组均取8只小鼠外周血、股骨。

2.2  外周血常规、骨髓单个核细胞计数以及造血组织增生度  使用全自动血细胞分析仪检测外周血细胞的数量，光学显微镜下计数骨髓单个核细胞数量并观察造血组织增生度，与对照组比较，模型组、治疗组各项指标均明显减少(P < 0.05)，证明造模成功，见表1和图1A-E。与模型组比较，应用当归多糖干预后上述指标得到不同恢复。

2.3  线粒体超微结构和数量  透射电镜下观察，对照组线粒体的大小和形状均正常；模型组线粒体结构破坏、嵴消失、数量减少；当归多糖处理后，治疗组线粒体数量及结构完整性得到显著改善，证明当归多糖可以维持再生障碍性贫血小鼠线粒体数量及功能，见图2。

2.4  线粒体膜电位检测结果  造模后第14天，模型组、治疗组线粒体膜电位(1.188±0.771，2.974±1.121)显著低于对照组(8.971±1.149)，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。当归多糖干预下，治疗组线粒体膜电位水平高于模型组  (P < 0.01)，见图2B，这表明当归多糖能促进再生障碍性贫血小鼠造血干细胞线粒体功能的恢复。

2.5  活性氧水平检测结果  造模后第14天，模型组、治疗组活性氧水平较对照组明显升高(P < 0.01)，在当归多糖的作用下，治疗组小鼠活性氧水平被明显抑制(P < 0.01)，见图3A。

2.6  细胞凋亡检测结果  造模后第14天，LSK细胞凋亡水平显著升高(P < 0.01)，在当归多糖的作用下，治疗组LSK细胞凋亡水平明显低于模型组(P < 0.01)，见图3B。

2.7  各组细胞Bcl-2、Bax、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白水平  治疗组的Bcl-2蛋白水平明显高于模型组，而Bax蛋白水平低于模型组，当归多糖能促进异常Bcl-2/Bax水平的显著恢复(P < 0.01)。cleaved caspase-9、cleaved caspase-3水平在应用当归多糖后也有不同程度的恢复，见图4。

2.8  当归多糖对p38信号通路的调节作用  模型组小鼠p38的磷酸化水平显著高于对照组，而当归多糖能显著抑制p38的磷酸化(P < 0.01)，见图5。

再生障碍性贫血是一种以全血细胞减少为主要特点的疾病。研究发现，造血干细胞过度凋亡、功能低下是再生障碍性贫血骨髓衰竭、全血细胞减少的主要机制之一^[1-2]。

线粒体是细胞维持功能的主要能量来源，又被称为细胞的能量工厂^[3]。课题组先前的研究表明，呼吸链功能障碍引起的线粒体突变及相关代谢组学异常可能是再生障碍性贫血骨髓衰竭的重要机制之一^[4]，线粒体功能异常、线粒体凋亡是触发细胞自噬、凋亡甚至坏死的重要原因^[5]。

研究表明，当归可以提高骨髓单个核细胞数量^[6]，其中当归多糖是当归最主要的效用成分之一。当归多糖可以通过抑制氧化应激损伤，保护DNA，增加端粒酶活性，从而提升CD34(+)造血干细胞数量^[7-10]。因此，作者设计了该实验，建立骨髓衰竭小鼠模型，探讨当归多糖通过干预异常体细胞免疫维持小鼠的线粒体功能稳态改善其造血功能的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年5至12月在山东济南解螺旋实验有限公司完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物及分组  SPF级雄性ICR小鼠72只，体质量18-22 g，6-8周龄，购买于朋悦实验动物繁育有限公司，由山东省实验动物中心检测合格，合格证号为37009200006508。将ICR小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组24只。

1.3.2  实验试剂和仪器  当归多糖(陕西慈缘生物技术有限公司)；注射用环磷酰胺(每支0.2 g，国药准字H32020857，江苏盛迪有限公司)；线粒体膜电位JC1试剂盒(北京康宝莱科技有限公司)；Cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-p38、p38抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；HEMAVET950FS动物血细胞分析仪；流式细胞仪(美国BD公司)；电子显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  制备再生障碍性贫血模型  参照文献[11]建立再生障碍性贫血模型。小鼠经2.0 Gy ⁶⁰Co γ照射20 min后给予40 mg/(kg·d)环磷酰胺腹腔注射，同时给予50 mg/(kg·d)氯霉素灌胃，持续3 d。

模型组和治疗组各随机处死8只小鼠以验证成模，并检测相关指标，将剩余小鼠给药干预：①正常对照组、模型组每天以0.2 mL生理盐水灌胃1次；②治疗组：根据前期实验，每天以200 mg/kg当归多糖(纯度≥ 95%)灌胃1次。各组连续用药14 d，分别于第1，7，14天取材进行检测。

1.4.2  外周血象及骨髓组织检测  造模后第1，7，14天，采用摘眼球取血方法获得外周血，利用HEMAVET950FS动物血细胞分析仪检测外周血常规。取小鼠右侧股骨，切片，苏木精-伊红染色、瑞吉氏染色，在400倍镜下估算造血组织增生度，证实造模成功。

1.4.3  骨髓单个核细胞计数  造模后第1，7，14天，采用颈椎脱臼的方法处死小鼠，取左侧股骨，使用含胎牛血清的1640培养液冲洗出骨髓腔内骨髓，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离、制备单细胞悬液(细胞浓度为1×  10⁹ L^-1)，×400倍显微镜下计数骨髓单个核细胞^[12]。

1.4.4  造血干细胞的获取及培养  根据文献[13]，获取骨髓单个核细胞后使用磁珠与流式结合的分选技术筛选Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺细胞(LSK细胞)作为造血干细胞。用磁珠分选出lin⁺和lin^-细胞，再用流式细胞仪分选出lin^-细胞中标记Sca-1和c-kit抗体双阳性的细胞群，即LSK细胞。流式细胞仪分选出LSK细胞群，使用的抗体包括Mac-1、Gr-1、Ter119、CD4、CD8a、CD3和B220。分选后细胞在IMDM培养液中培养以备用。 

1.4.5  线粒体数量检测  造模后第14天取各组小鼠右侧股骨，切取厚度小于1 mm的样本，立即放入2.5%戊二醛溶液中固定，经饿酸后固定、脱水、渗透、环氧树脂包埋、超薄切片、醋酸铀枸橼酸铅染色，在透射电镜下观察线粒体的形态变化，20 000倍显微镜下每组观察20个视野中骨髓造血细胞线粒体的形态，8 000倍显微镜下每组选择相同的一类细胞(30个)进行线粒体计数。

1.4.6  流式细胞术定量分析LSK细胞线粒体膜电位  取2× 10⁵ LSK细胞加入0.5 mL细胞培养液中，再加入0.5 mL JC-1染色液，37 ℃细胞培养箱中放置15 min，4 ℃离心4 min，洗涤，重悬细胞，上流式细胞仪检测，通过分析2个通道的比例(红色，Q3)/(绿色，Q4)来判断线粒体膜电位水平。

1.4.7  LSK细胞活性氧水平检测  取2×10⁵ LSK细胞加入二乙酸二氯荧光素孵化45 min，使用荧光酶标仪检测活性氧水平，检测波长485 nm。

1.4.8  流式细胞术检测LSK细胞凋亡情况  收集2×10⁵ LSK细胞加入5 μL Annexin V-EGFP混匀，加入5 μL Propidium Iodide混匀，室温避光反应15 min，上流式细胞仪检测。

1.4.9  Western blot检测LSK细胞Bcl-2，Bax，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3和p38蛋白的表达水平  收集5×10⁵ LSK细胞，抽提总蛋白，蛋白定量检测试剂盒测定蛋白量，取40 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，40 mA恒流条件下4 ℃转移过夜；TBS/T洗膜，分别加入一抗4 ℃孵育过夜(Bcl-2，Bax，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3和p38抗体)，再加入HRP标记的二抗孵育1 h，加入ECL发光剂，采用灰度扫描系统测定软件(National Institutes of Health, Bethesda，MD，USA)分析目的蛋白条带。

1.5  主要观察指标  ①骨髓活检、外周血血常规检测以验证造模是否成功；②线粒体数量、LSK细胞线粒体膜电位、LSK细胞凋亡情况，LSK细胞线粒体相关凋亡蛋白水平。

1.6  统计学分析  使用SPSS 19.0进行数据的统计分析，计量资料以x(_)±s表示，组间差异使用单因素方差分析，多重比较使用修正的F 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

再生障碍性贫血是一种造血功能衰竭性疾病，中药对该病的疗效较好。当归功用养血活血，是中医治疗再生障碍性贫血的最常用药物之一。当归多糖是当归的主要效用成分，其可以有效改善造血微环境^[14-15]，并且能通过调控线粒体自噬稳态以改善造血干细胞数量及功能^[16]，因此实验应用当归多糖以进一步明确其干预线粒体功能异常，纠正造血衰竭的作用机制。

mtDNA的异常与恶性肿瘤、神经系统等疾病的发生发展关系密切，拷贝数的减少及突变常常是这些疾病发病的重要原因^[17-18]。研究已经证实，严重的全血细胞减少症尤其是骨髓功能衰竭常常与mtDNA突变相关^[19-20]，这主要是因为拷贝数量水平的异常、线粒体相关蛋白质合成及功能异常，最终导致肿瘤或正常细胞凋亡、死亡及自噬的异常。线粒体ATP质量和数量不足造成的能量代谢障碍也是染色体不稳定的关键因素之一^[21]。基于作者先前对再生障碍性贫血线粒体突变的研究^[4]，该实验试图分析当归多糖能否通过逆转再生障碍性贫血小鼠线粒体凋亡途径抑制其骨髓衰竭。

再生障碍性贫血的一个重要发病原因就是造血干细胞的显著减少，该实验应用放疗与环磷酰胺、氯霉素的复合法制备造血干细胞衰竭模型，骨髓增生极度低下，符合再生障碍性贫血骨髓衰竭的特点；同时外周血三系均明显降低，表明该模型细胞学、病理学等方面均符合骨髓衰竭的特点^[1-2]。在应用当归多糖干预后，骨髓单个核细胞等数值相比模型组显著增加。此外，LSK细胞是目前比较公认的造血干细胞，该细胞在低氧状态下可以经由NF-κB通路调控凋亡^[22]，在放疗后其凋亡水平大幅上升，而应用PHD抑制剂roxadustat(FG-4592)可以纠正该凋亡趋势^[23]。骨髓衰竭模型中该细胞的超氧阴离子水平升高会影响线粒体数量及功能^[24]，而多项研究发现当归多糖可以通过降低凋亡率干预H9c2细胞、造血干细胞的凋亡趋势^[25-26]。

该研究发现再生障碍性贫血模型LSK细胞线粒体数量呈显著下降的趋势。再生障碍性贫血模型小鼠和对照组之间活性氧水平、细胞凋亡水平、Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3及p38水平有显著差异，而当归多糖可以纠正该部分异常，能降低活性氧水平、调控线粒体凋亡相关标志物水平来抑制LSK细胞的异常凋亡。

目前再生障碍性贫血的治疗主要有环孢素、兔抗人抗胸腺细胞球蛋白等免疫抑制剂、雄性激素以促进造血恢复，还有造血干细胞移植等方案^[27]。如何在免疫抑制剂应用后进一步促进造血干细胞功能及数量的恢复，是个热点问  题^[28-29]，也是中医药治疗方案的意义所在。作者之前提出了线粒体与肾虚相关的假说，中医认为骨髓衰竭的病因病机多为肾虚所导致的气血两虚，而该研究结果显示线粒体作为供能工厂在骨髓衰竭中出现异常，二者观点相符合，也是当归纠正气血两虚可以改善线粒体功能从而逆转骨髓衰竭的立论依据。该研究选用的当归多糖能够通过干预造血干细胞线粒体凋亡途径，有效抑制再生障碍性贫血小鼠骨髓衰竭，明显提升外周血水平，阐明了其干预骨髓衰竭的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

再生障碍性贫血：①血象：呈全血细胞减少，少数病例早期可仅1系或2系细胞减少。贫血属正常细胞型，亦可呈轻度大红细胞。红细胞轻度大小不一，但无明显畸形及多染现象，一般无幼红细胞出现。网织红细胞绝对值和比例显著减少，中性粒细胞减少低于0.5×10⁹ L^-1，血小板低于20×10⁹ L^-1。②骨髓象：骨髓涂片大体观察油滴增多，骨髓小粒镜检空虚，非造血细胞和脂肪细胞增多，一般在50%以上。

线粒体凋亡：当线粒体膜电位下降，线粒体膜通透性增加，线粒体内促凋亡因子(例如Cyt C、AIF、SMAC/DIABLO、HTRA2/OMI、ENDOG)释放到胞质中。Cyt C与Apaf-1相互作用，在ATP和dATP的协助下形成凋亡复合体，凋亡复合体通过招募并激活Pro-Caspase9，形成Caspase9全酶。Caspase9全酶进一步激活效应Caspase3和Caspase7，启动Caspase级联反应，切割细胞中如α-tubulin、Actin、PARPA、Lamin等超过100种的底物，最终导致细胞凋亡。

目前再生障碍性贫血的治疗主要有环孢素等免疫抑制剂、雄性激素以促进造血恢复，还有造血干细胞移植等方案。如何在应用西药的同时进一步促进造血干细胞功能及数量的恢复，是个热点问题，也是中医药治疗方案的意义所在。该研究选用当归多糖能够通过干预造血干细胞线粒体凋亡途径，有效抑制再生障碍性贫血小鼠骨髓衰竭，明显提升外周血水平，阐明了其干预骨髓衰竭的机制。该研究从造血干细胞线粒体凋亡异常水平入手，观点较新，在国内外已经成为一个热点方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程